双膦酸盐对破骨细胞分化及抗酒石酸酸性磷酸酶的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.38.001

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (38): 6069-6073.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.38.001

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双膦酸盐对破骨细胞分化及抗酒石酸酸性磷酸酶的影响

董伟，冯晓洁，梁永强，邓久鹏，温黎明，戚孟春

河北联合大学口腔医学院，河北省唐山市 063000

收稿日期:2014-08-11 出版日期:2014-09-10 发布日期:2014-09-10
通讯作者: 戚孟春，博士，教授，硕士生导师，联合大学口腔医学院，河北省唐山市 063000
作者简介:董伟，男，1981年生，汉族，辽宁省辽中县人， 2011年河北联合大学口腔医学院毕业，硕士，讲师，主要从事骨组织工程研究工作。
基金资助:
国家自然科学基金(81270965)；河北省自然科学基金(C2011401044)

Effect of bisphosphonate on osteoclast differentiation and tartrate-resistant acid phosphatase

Dong Wei, Feng Xiao-jie, Liang Yong-qiang, Deng Jiu-peng, Wen Li-ming, Qi Meng-chun

School of Stomatology, Hebei United University, Tangshan 063000, Hebei Province, China

Received:2014-08-11 Online:2014-09-10 Published:2014-09-10
Contact: Qi Meng-chun, M.D., Professor, Master’s supervisor, School of Stomatology, Hebei United University, Tangshan 063000, Hebei Province, China
About author:Dong Wei, Master, Lecturer, School of Stomatology, Hebei United University, Tangshan 063000, Hebei Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81270965; the Hebei Natural Science Foundation, No. C2011401044

摘要/Abstract

摘要：

背景：抗酒石酸酸性磷酸酶是破骨细胞分化及骨吸收功能的特异性标志酶，是破骨细胞分化成熟的标志。
目的：观察双膦酸盐对破骨细胞分化及骨吸收功能相关因子抗酒石酸酸性磷酸酶的影响。
方法：小鼠单核巨噬细胞RAW264.7诱导培养破骨细胞。实验分2组：对照组开始时加入质量浓度100 μg/L核因子kB受体活化因子配体进行诱导至收获细胞，双膦酸盐组在对照组的基础上加入10-7 mol/L阿仑膦酸盐处理至收获细胞。培养第7天检测各组破骨细胞生成和骨吸收功能，免疫荧光检测两组抗酒石酸酸性磷酸酶表达的差异，Western blot检测抗酒石酸酸性磷酸酶蛋白表达情况。
结果与结论：各组细胞均有抗酒石酸酸性磷酸酶阳性多核破骨细胞生成，并在牙本质磨片上形成吸收陷窝；但对照组抗酒石酸酸性磷酸酶阳性多核细胞数目、吸收陷窝数目及陷窝面积均大于双膦酸盐组(P < 0.01)。免疫荧光检测显示，对照组抗酒石酸酸性磷酸酶表达均强于双膦酸盐组(P < 0.01)。Western blot检测显示，双膦酸盐组抗酒石酸酸性磷酸酶蛋白的表达低于对照组(P < 0.01)。说明双膦酸盐通过抑制抗酒石酸酸性磷酸酶蛋白的表达，阻碍破骨细胞分化生成及骨吸收功能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 骨组织构建, 双膦酸盐, 破骨细胞, 抗酒石酸酸性磷酸酶, 免疫印迹法, 骨吸收陷窝, 免疫荧光化学检测, 骨质疏松, 扫描电镜, 牙本质磨片, 核因子kB受体活化因子配体, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Tartrate-resistant acid phosphatase is a specific marker for osteoclast differentiation and bone resorption, which is a sign of osteoclast maturity.
OBJECTIVE: To study the effect of alendronate on tartrate-resistant acid phosphatase related to osteoclast differentiation and bone resorption.
METHODS: Osteoclasts were cultured by mouse monocyte-macrophage cell line-RAW264.7. The cells were divided into two groups: control group, treated with 100 μg/L receptor activator of nuclear factor κB ligand factor; alendronate group, treated with 100 μg/L receptor activator of nuclear factor κB ligand factor+10-7 mol/L alendronate. Osteoclastogenesis and resorption function of osteoclasts were examined at 7 days of culture. Gene expression of tartrate-resistant acid phosphatase was detected by immunofluorescence method. Western blot assay was used to detect protein expression of tartrate-resistant acid phosphatase.
RESULTS AND CONCLUSION: Tartrate-resistant acid phosphatase positive multinuclear cells were observed and resorption lacunae formed in two groups. Control group showed the higher number of tartrate-resistant acid phosphatase positive multinuclear cells and larger size of resorption lacunae than the alendronate group (P < 0.01). Immunofluorescence showed expression of tartrate-resistant acid phosphatase was higher in the control group than the alendronate group (P < 0.01); furthermore, the protein expression of tartrate-resistant acid phosphatase was also lower in the alendronate group than the control group (P < 0.01). These findings indicate that bisphosphonates could strongly inhibit osteoclastogenesis and its resorption function by inhibiting protein expression of tartrate-resistant acid phosphatase.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: tissue engineering, diphosphonates, osteoclasts, osteoporosis

中图分类号:

R318

董伟，冯晓洁，梁永强，邓久鹏，温黎明，戚孟春. 双膦酸盐对破骨细胞分化及抗酒石酸酸性磷酸酶的影响[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(38): 6069-6073.

Dong Wei, Feng Xiao-jie, Liang Yong-qiang, Deng Jiu-peng, Wen Li-ming, Qi Meng-chun. Effect of bisphosphonate on osteoclast differentiation and tartrate-resistant acid phosphatase[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(38): 6069-6073.

图/表（结果） 2

参考文献

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引言

材料方法

设计：细胞学体外实验。

时间及地点：于2013年2月至2014年7月在河北联合大学分子生物学实验室完成。

材料：

双膦酸盐对破骨细胞分化及抗酒石酸酸性膦酸酶的影响实验相关试剂：
试剂	来源
核因子kB受体活化因子配体(RANKL)	Biovision
DMEM培养基	Gibco
兔抗鼠抗酒石酸酸性膦酸酶多克隆抗体	SANTA CRUZ
羊抗兔辣根过氧化物酶标记IgG和RIPA	武汉博士德
阿仑膦酸盐，DAPI，FITC标记的羊抗兔IgG，抗酒石酸酸性蹸酸酶染色试剂盒	Sigma

方法：

破骨细胞的培养及分组：RAW264.7细胞以1×10⁵/孔接种于48孔培养板中，DMEM培养基(含体积分数15%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素)培养。实验分为2组：对照组开始时加入质量浓度100 μg/L核因子kB受体活化因子配体进行诱导至收获细胞；双膦酸盐组在对照组的基础上加入10^-⁷ mol/L阿仑膦酸盐处理至收获细胞^[6-7]。

抗酒石酸酸性磷酸酶染色：各组于处理后第7天收获细胞^[5]，按抗酒石酸酸性磷酸酶染色试剂盒操作步骤进行染色，显微镜100倍下随机选取5个视野计数抗酒石酸酸性磷酸酶染色阳性细胞(细胞核≥ 3个)数目，5个视野的平均数为该细胞爬片的破骨细胞数目。

牙本质磨片检测：各组取培养至第7天的牙本质磨片^[5]，体积分数2.5%戊二醛4 ℃固定7 min，1 mol/L氢氧化胺中以50 Hz超声清洗5 min，再经蒸馏水超声清洗 5 min，共3次；随后用体积分数2.5%戊二醛固定2 h，体积分数1%饿酸固定2 h，乙醇逐级脱水，醋酸异戊酯置换，二氧化碳临界点干燥，镀金，扫描电镜(HITACHI S-4800)观察吸收陷窝。每孔牙本质磨片上随机选取5个视野(250倍)，用医学数码图像分析系统Med 6.0测量5个视野吸收陷窝总数目及总面积，数值/5代表该磨片的陷窝数目及面积。

免疫荧光染色：取培养至4 d细胞用PBS冲洗^[8]，然后 40 g/L多聚甲醛固定10 min、体积分数0.5%Triton穿孔 15 min、1%BSA封闭30 min，期间均用PBS冲洗2次，每次5 min。加入5%BSA稀释的兔抗鼠抗酒石酸酸性磷酸酶多克隆一抗，4 ℃过夜。PBS冲洗后，加入体积分数5%BSA稀释的FITC标记的羊抗兔IgG，37 ℃ 杂交2 h，质量浓度5 mg/L DAPI染色2 min，于共聚焦显微镜下观察^[9]。应用Photoshop CS3软件对抗酒石酸酸性磷酸酶阳性细胞荧光灰度值进行测量。

Western blot检测：各组细胞培养48 h后^[10]，提取总蛋白质，测定蛋白质浓度后进行凝胶电泳，每孔加样35 μg，煮沸变性5 min，应用浓缩胶和分离胶分离蛋白，电转至PVDF膜上，体积分数5%BSA溶液室温孵育1 h，分别加入兔抗鼠抗酒石酸酸性磷酸酶多克隆一抗(1∶1 000)孵育，羊抗兔辣根过氧化物酶标记IgG二抗(1∶300)结合一抗。按照化学发光试剂盒说明书制备反应液，室温孵育5 min；以GAPDH作为对照。用Image J分析软件检测膜上每个蛋白条带的灰度值。

主要观察指标：各组抗酒石酸酸性磷酸酶蛋白的表达，牙本质磨片吸收陷窝计数和陷窝面积。

统计学分析：计量资料用x(_)±s表示。用SPSS 11.0统计学软件对多组间数据进行单因素方差分析，组间均数的两两比较比较采用SNK检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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讨论

人体内骨的新陈代谢受到成骨细胞和破骨细胞的共同调控。成骨细胞形成骨质，破骨细胞介导体内骨吸收的产生。在正常人体内，两者处于相对动态平衡^[11]。然而，当破骨细胞功能出现异常，上述平衡被打破，多种骨骼疾病(如骨质疏松)就会发生。现阶段，研究破骨细胞的分化及骨吸收功能成为了科学研究的热点领域。

在破骨细胞的众多信号分子中，抗酒石酸酸性磷酸酶为至关重要的一个，被称为特异性标志酶^[12]，是破骨细胞分化的标记物，也与破骨细胞骨吸收功能密切相关^[13-15]。抗酒石酸酸性磷酸酶作为破骨细胞的分化成熟与否的标志性产物，通过调节破骨细胞对骨基质吸收及胶原蛋白的转化来影响破骨细胞的功能^[16-17]。破骨细胞突变主要表现为

表1 各组抗酒石酸酸性磷酸酶阳性破骨细胞计数及牙本质磨片吸收陷窝计数和陷窝面积变化

Table 1 The number of tartrate-resistant acid phosphatase positive osteoclasts, number and size of resorption lacunae formed on dentin slices in each group (x(_)±s)

表注：与对照组比较，^aP < 0.01。对照组吸收陷窝数目和面积均高于较双膦酸盐组。

组别	TRAP阳性破骨细胞计数(个)	吸收陷窝计数(个)	吸收陷窝面积(μm²)
对照组双膦酸盐组	181.40±35.32 42.80±6.91^a	74.20±13.66 29.00±10.25^a	4 011.20±417.35 759.60±75.06^a

单核化以及抗酒石酸酸性磷酸酶表达水平的降低。

细胞内抗酒石酸酸性磷酸酶的活化表达受到破骨细胞关键信号分子NFATc1的调控^[18]。在破骨细胞分化阶段，随着破骨细胞前体与骨表面的接触，核因子kB受体活化因子配体与破骨细胞前体表面受体TRAF6结合后，引起了下游一系列信号因子的级联作用^[19-22]。核因子kB受体活化因子诱导细胞内Ca²⁺波动，Ca²⁺/钙调蛋白依赖的钙调磷酸酶被激活，使胞浆内NFATc1蛋白异位进入细胞核^[23]，随后，核转录因子κB二聚体转移至细胞核中与NFATc2共同作用于NFATc1基因启动子，诱发NFATc1基因初始表达，NFATc1基因表达进入自发扩增阶段；此时，在核因子kB受体活化因子配体刺激下，JUN被激活，导致c-Jun转录因子的活化，c-Jun与c-Fos形成催化蛋白1(AP-1)，c-Fos被激活，选择性的募集到NFATc1基因启动子上，与核转录因子κB、NFATc2协同诱发异位至细胞核内的NFATc1基因表达，最终导致特异性抗酒石酸酸性磷酸酶的表达，破骨细胞分化形成。随后，破骨细胞进入骨吸收功能形成阶段，破骨细胞皱褶处分泌CTSK^[24]，CTSK的分泌促使接触骨组织内的RGD基序逐渐释放，与avb3整合素受体相互作用诱发肌动蛋白环(actin rings)形成，内部为封闭区。随后，骨吸收程序启动，大量CTSK从胞内溶酶体中释放至封闭区内骨吸收区域，对此区域内的Ⅰ型胶原蛋白进行大量降解^[25-26]，随之骨吸收陷窝形成。

近几年，众多研究各种因素对破骨细胞分化及功能影响的研究都将对抗酒石酸酸性磷酸酶表达的影响作为主要研究内容，将抗酒石酸酸性磷酸酶染色检测作为首要指标。如黄生高等^[27]研究压应力对小鼠单核细胞RAW264.7抗酒石酸酸性磷酸酶表达的影响；陈国仙等^[28]研究不同频率振动应力对RAW264.7细胞体外分化的影响时；刘强等^[29]在研究阿仑膦酸盐对破骨细胞生成的抑制及钙离子激动剂的拮抗效应时；丁士育等^[30]在不同培养方法对共培养体系中破骨细胞生成影响的研究时，均首先通过抗酒石酸酸性磷酸酶染色来检测破骨细胞分化是否成熟。但上述研究中未应用其他检测手段(Western blot、PCR等)检测破骨细胞抗酒石酸酸性磷酸酶的表达水平。

本次实验在RAW264.7向破骨细胞分化过程中，加入双膦酸盐进行药物干预，通过抗酒石酸酸性磷酸酶染色和骨吸收陷窝检测观察其对破骨细胞分化及骨吸收功能的影

响，并应用免疫荧光化学检测和Western blot检测破骨细胞内抗酒石酸酸性磷酸酶表达水平的变化。实验结果表明，双膦酸盐阻碍了破骨细胞的分化，同时其骨吸收功能也受到了明显抑制。实验结果表明，在双膦酸盐的作用下，破骨细胞特异性标志酶抗酒石酸酸性磷酸酶的表达减少，结果导致其分化受到严重影响，其必然影响后续骨吸收程序的启动，从而最终造成破骨细胞骨吸收功能的降低。实验的研究结果进一步揭示了双膦酸盐对破骨细胞生成抑制作用的分子学机制，为双膦酸盐的临床应用提供理论基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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